À pesca: rastreio de rede de proteínas identifica novos alvos terapêuticos na doença de Huntington

A proteína huntingtina mutante não causa danos isoladamente – todas as proteínas funcionam em redes conectadas. Investigadores do Buck Institute for Research on Aging, na Califórnia, realizaram um rastreio em grande escala para identificar redes de proteínas que podem estar a atuar para aliviar ou agravar os efeitos nocivos da mutação da doença de Huntington. Será que manipular estas redes oferece novas opções terapêuticas para a DH?

A proteína Huntingtina: Chegar à raiz da questão

2013 assinala o 20.º aniversário da descoberta da causa genética da doença de Huntington. Pela primeira vez, os cientistas descobriram que uma sequência de ADN repetida num único gene era anormalmente longa em pessoas que desenvolvem DH. Cada um dos nossos genes fornece as instruções de que as nossas células necessitam para produzir uma determinada proteína, que, no caso do gene da DH, é uma proteína que chamamos huntingtina. A mutação deste conjunto de instruções genéticas faz com que a proteína huntingtina seja construída com um erro, levando a alterações subtis no comportamento celular da proteína. À medida que uma pessoa com DH envelhece, estas alterações têm consequências graves, particularmente nos neurónios do cérebro.

Esta descoberta inovadora tornou possível aos cientistas concentrarem os seus esforços numa tarefa muito específica; para compreenderem verdadeiramente a doença, precisariam de aprender tudo o que pudessem sobre a própria proteína huntingtina. Isto significa saber não só o que a proteína huntingtina faz no corpo de um indivíduo saudável, mas também o que está a correr mal na doença.

O que poderá ser tão importante numa proteína?

As proteínas são frequentemente referidas como tendo ‘funções’ específicas na célula. Para compreender o que isto significa, pode ser útil imaginar cada célula do nosso corpo como uma fábrica movimentada. É preciso muita gente diferente a fazer muitos trabalhos diferentes para manter o funcionamento de uma fábrica sem problemas. Todos estes empregados têm um conjunto específico de competências e, se uma pessoa não fizer o seu trabalho corretamente, a produtividade de toda a fábrica está em risco.

Bem, se as nossas células são como fábricas, as proteínas seriam os empregados. Tal como os trabalhadores individuais, cada proteína tem de fazer um conjunto de trabalhos, ou ‘funções’. Quando a proteína huntingtina sofre uma mutação na DH, isso afeta a forma como a huntingtina desempenha as suas funções.

Tal como nenhuma pessoa conseguiria fazer todos os trabalhos na fábrica, nenhuma proteína funciona completamente sozinha. Em vez disso, existe como parte de uma rede de proteínas que interagem entre si para trabalhar eficientemente como uma equipa. Por isso, para compreender a função de uma proteína, os cientistas também devem determinar que relação ela tem com outras proteínas na célula.

Estimou-se que o nosso ADN fornece as instruções para construir mais de 30.000 proteínas diferentes. Compreender como todas estas proteínas estão ligadas umas às outras e como podem ser afetadas na DH torna-se um desafio quase esmagador.

Hipótese e descoberta

Para ajudar a lidar com a complexidade da biologia moderna, alguns investigadores passaram da investigação tradicional ‘orientada por hipóteses’ para uma abordagem designada por investigação ‘orientada pela descoberta‘.

Uma hipótese é uma previsão que um cientista faz com base no que já sabe. Uma boa hipótese é aquela que pode ser facilmente testada. Aqui fica um exemplo simples: digamos que levantamos a hipótese de que os gatos preferem comer frango a atum. Uma forma de testar isto pode ser colocar duas tigelas, uma contendo cada escolha. Ao contar o número de gatos diferentes que se aproximam de cada tigela, serão fornecidas provas para apoiar ou rejeitar a hipótese.

A investigação orientada por hipóteses funciona muito bem, desde que já se saiba uma quantidade razoável sobre a coisa em particular que se está a investigar. No entanto, quando se pretende descobrir o que uma proteína faz numa rede de milhares de outras proteínas diferentes, o progresso pode ser bastante lento quando se coloca apenas uma questão de cada vez. Imagine que queria descobrir qual era a comida preferida dos gatos entre 30.000 alimentos – mas só podia testá-los dois de cada vez!

A investigação orientada pela descoberta é uma forma de destacar os processos biológicos que podem estar envolvidos numa doença. Poder-se-ia dizer que esta abordagem gera não respostas, mas melhores perguntas. Diz aos investigadores onde concentrar a sua atenção para estudos futuros.

As experiências orientadas pela descoberta, designadas por rastreios, envolvem milhares de mini-experiências diferentes realizadas simultaneamente.

De certa forma, os rastreios biológicos são um pouco como a diferença entre pescar com uma rede de arrasto em vez de uma cana e linha. É uma técnica poderosa, mas requer mais esforço para separar o que é apanhado.

Silenciar genes individuais com RNAi

Um novo estudo publicado na revista PLOS Genetics, liderado pelo Dr. Robert Hughes do California Buck Institute for Research on Aging, descreve um rastreio orientado pela descoberta que procura redes de proteínas que são afetadas pela huntingtina mutante. Utilizando uma tecnologia designada por RNAi, a equipa de Hughes trabalhou para identificar proteínas individuais que podem estar a contribuir para os efeitos nocivos da proteína mutante.

RNAi significa interferência de RNA e é uma forma de ‘silenciamento de genes’. O RNAi é utilizado para reduzir o nível de uma única proteína na célula. Isto ajuda a determinar o que essa proteína pode fazer e a sua importância para outras atividades celulares.

O RNAi interceta a mensagem química que é produzida quando uma proteína está a ser feita e destrói-a – impedindo que a proteína seja construída. Praticamente qualquer gene e a sua proteína correspondente podem ser alvo de RNAi.

Um rastreio de RNAi e alguns fragmentos tóxicos

Primeiro, a equipa de Hughes cultivou células em laboratório que tinham sido geneticamente modificadas para as fazer produzir a parte mais prejudicial da proteína huntingtina mutante. Este ‘fragmento’ de huntingtina mutante faz com que as células morram mais rapidamente se os nutrientes adequados não estiverem disponíveis. A saúde das células pode ser avaliada medindo as alterações que ocorrem quando uma célula está a morrer.

Para identificar proteínas envolvidas nos efeitos nocivos da huntingtina mutante, o Dr. Hughes e os seus colegas utilizaram uma ‘biblioteca’ de mais de 7.000 produtos químicos de RNAi, cada um deles visando uma proteína diferente.

Esses 7.000 produtos químicos de RNAi foram cada um testados num lote separado de células. Desta forma, os investigadores conseguiram analisar os efeitos de cada proteína que foi ‘desligada’. Se o silenciamento de um gene faz com que as células morram mais rapidamente, sugere que a proteína correspondente pode normalmente estar a proteger a célula. E se as células morrerem mais lentamente, significa que a proteína pode estar a piorar as coisas na DH.

A processar os números

Experiências como esta produzem uma tonelada de dados, pelo que os computadores são utilizados para analisar e dar sentido a eles. Felizmente, muitas redes de proteínas já foram mapeadas utilizando abordagens científicas mais tradicionais.

O computador cria um novo mapa, colocando os ‘acertos’ dos novos dados no mapa de rede existente. Utilizando esta técnica, a equipa de Hughes encontrou algumas redes que tinham mais acertos do que o esperado, indicando que podem ser importantes para o desenvolvimento da doença de Huntington.

Algumas destas redes já eram conhecidas de estudos anteriores, dando aos cientistas confiança de que a sua abordagem baseada na descoberta estava a funcionar. No entanto, também se depararam com redes que não tinham sido implicadas na DH antes. Uma rede em particular, ligada à huntingtina através de uma proteína designada por RRAS, foi destacada pelo rastreio.

Devido aos enormes números envolvidos, é importante realizar experiências de acompanhamento separadas para verificar as descobertas mais marcantes. Por isso, a equipa de Hughes realizou experiências em vários modelos celulares diferentes, bem como num modelo de mosca-da-fruta com DH, e descobriu que a RRAS era capaz de proteger contra a morte celular. Melhor ainda, conseguiram identificar atividades específicas das proteínas dentro da rede que poderiam ser mais fáceis de atingir com fármacos.

Conhecer os nossos limites

O aspeto mais interessante deste estudo é o facto de ter destacado novas redes que podem estar envolvidas na doença de Huntington. No entanto, tal como não existe uma rede de pesca suficientemente grande para arrastar todo o oceano, algumas redes de proteínas importantes foram provavelmente perdidas com este trabalho.

Uma das razões para isto é o modelo celular utilizado no rastreio. Em vez de fazer com que as células produzam o gene da huntingtina mutante de comprimento total, os investigadores optaram por utilizar apenas um pequeno fragmento. Isso significa que quaisquer proteínas ou redes que dependam da proteína huntingtina de comprimento total terão sido perdidas.

Outra razão é o tipo de célula utilizado nas experiências. Este trabalho foi realizado com células disponíveis comercialmente designadas por HEK293. Estas células são fáceis de cultivar em grandes lotes para experiências em grande escala como esta. Mas depois de serem alteradas para terem propriedades tão fáceis de usar, já não se comportam da mesma forma que uma célula normal e saudável no corpo – e são certamente muito diferentes dos neurónios.

Para compensar estas potenciais fraquezas no modelo experimental do rastreio inicial, todos os ‘acertos’ de RNAi foram testados novamente em linhas celulares que produzem huntingtina de comprimento total, bem como em modelos de mosca-da-fruta mais complexos da doença. E a rede RRAS foi examinada num modelo de rato com DH.

O que vem a seguir?

Este trabalho representa um grande esforço por parte dos investigadores envolvidos. Os rastreios biológicos exigem muito planeamento cuidadoso! No entanto, com este estudo no seu currículo, a equipa poderá continuar este trabalho realizando um rastreio semelhante em células contendo huntingtina de comprimento total.

No que diz respeito aos acertos do rastreio atual, ainda há muito mais para explorar. Uma abordagem poderá ser investigar a rede RRAS – ou mesmo repetir o rastreio – em modelos celulares mais ‘precisos’, tais como células estaminais geradas a partir de doentes reais com DH.

Seja qual for o futuro desta investigação, este é um bom exemplo de como a investigação orientada pela descoberta pode gerar novos alvos e ideias, desde que permaneçamos conscientes das limitações das técnicas. Aguardamos com expectativa saber mais sobre como estas novas redes de proteínas influenciam o desenvolvimento da DH, bem como sobre como podem ser manipuladas na procura de tratamentos.

Aprende mais

• Artigo da equipa de Hughes na PLOS Genetics (acesso aberto)