Avanços importantes nas ferramentas de edição do genoma de última geração para a doença de Huntington

Nos últimos dias, surgiram várias notícias sobre a utilização de algo chamado edição do genoma como uma potencial terapia para doenças genéticas como a doença de Huntington. Estas abordagens, que incluem ferramentas com nomes exóticos como nucleases de dedos de zinco e CRISPR/Cas9, diferem das formas mais tradicionais de reduzir o impacto da mutação da HD nas células. O que há de novo nesta área de investigação entusiasmante?

Atualização sobre a redução da huntingtina

Tem havido muito entusiasmo recentemente em torno do avanço de um novo tratamento de redução da huntingtina, por vezes chamado silenciamento genético, para a doença de Huntington. O primeiro destes fármacos a chegar a ensaios clínicos em humanos com HD, chamado oligonucleótidos antisense (ASO), reduz a quantidade de proteína huntingtina mutante prejudicial que é criada por uma célula e, em última análise, limita os danos que pode causar.

Aqueles que têm acompanhado sabem que o primeiro ensaio que avalia a segurança dos ASO em pacientes humanos com HD está atualmente em curso (http://en.hdbuzz.net/204), mas alguns leitores também se podem lembrar que os ASO não são os únicos intervenientes quando se trata de formas inovadoras de reduzir a proteína huntingtina prejudicial.

De facto, duas outras novas técnicas terapêuticas conhecidas como nucleases de dedos de zinco e CRISPR têm gerado algum burburinho recentemente. Embora já tenhamos abordado ambas estas abordagens anteriormente (http://en.hdbuzz.net/023), uma rápida revisão de como funcionam e das diferenças entre elas será útil para compreender algumas novas descobertas.

Provavelmente recordas das tuas primeiras aulas de biologia que o teu ADN fornece um conjunto detalhado de instruções sobre como construir, bem, tu! Cada célula do teu corpo é muito parecida com um estaleiro de construção, e o teu ADN é o projeto mestre com instruções para pegar nos blocos de construção mais básicos (chamados aminoácidos) e transformá-los em proteínas funcionais que contribuem para todas as tuas características únicas e garantem que as coisas no teu corpo continuem a funcionar sem problemas.

Chamamos às instruções de ADN para construir proteínas específicas genes, e cada um de nós tem duas cópias do gene para produzir uma proteína importante que é chamada huntingtina. Os sintomas associados à doença de Huntington ocorrem porque um destes conjuntos de instruções genéticas desenvolveu um erro de impressão que faz com que a proteína huntingtina seja construída incorretamente. Na grande maioria dos pacientes com HD, isto leva a dois tipos de proteína huntingtina – uma proteína huntingtina mutante que já não funciona corretamente e uma proteína huntingtina saudável que funciona.

Vamos começar a construir…

Dentro de cada uma das células do teu corpo, o teu ADN é armazenado e protegido no interior de um local chamado núcleo, tal como o projeto mestre de um edifício que foi trancado pelo gestor de construção no seu escritório para evitar que seja danificado.

Num estaleiro de construção real, seria muito lento e ineficiente se cada trabalhador fosse obrigado a deslocar-se ao escritório do gestor de construção para utilizar o mesmo conjunto de instruções ao construir, e, como se verifica, o mesmo se aplica às nossas células.

Para evitar este problema, é feita uma cópia de trabalho das instruções que é utilizada como modelo para a construção de proteínas. Esta cópia de trabalho é chamada RNA mensageiro, ou mRNA, e é copiada do ADN original e enviada para o interior da célula, onde é utilizada para construir muitas cópias da(s) mesma(s) proteína(s) numa escala maior.

Se o nosso ADN é como o projeto mestre original, então o mRNA é muito parecido com as cópias individuais do projeto que são entregues pelo gestor de construção à sua equipa para que possam começar a construir de forma eficiente. Isto pode parecer confuso, mas para o nosso propósito, tudo o que precisas de saber são os três passos envolvidos na construção de uma proteína: DNA -> mRNA -> proteína.

ASO, Dedos de Zinco, & CRISPR: Mesmo Objetivo, Meios Diferentes

É importante fazer a distinção entre o gene HD no ADN e no mRNA porque são alvo de diferentes terapias de redução da Huntingtina em rápido desenvolvimento. Estas incluem um leque de diferentes técnicas como ASO, dedos de zinco e uma nova abordagem chamada CRISPR/Cas9. No fundo, todas estas técnicas terapêuticas têm o mesmo objetivo em mente – reduzir a quantidade de proteína huntingtina mutante prejudicial produzida numa célula – mas atingem este objetivo de formas muito diferentes.

Das três opções, os ASO existem há mais tempo, o que pode não te surpreender, uma vez que surgiram como os primeiros a serem avaliados em pacientes humanos com HD. Os ASO funcionam dizendo às células para dispararem sobre o mensageiro, neste caso, o intermediário de mRNA que transporta as instruções do ADN para produzir uma proteína. Numa célula tratada, os fármacos ASO literalmente aderem ao mRNA que fornece as instruções para produzir a proteína huntingtina mutante prejudicial e convencem a célula a cortá-la para que a proteína deixe de poder ser produzida.

Muitos cientistas e membros da comunidade HD estão muito entusiasmados com o avanço da terapia ASO como uma opção de tratamento para a HD, mas o facto é que a terapia ASO não tem como alvo a causa última da HD (o gene HD defeituoso codificado no ADN de uma pessoa) e permanece um passo removido ao ter como alvo o mRNA. Como o gene mutante ainda está presente no ADN, o mRNA e a proteína mutantes continuariam a ser produzidos em células tratadas com ASO. Isto significa que, tanto quanto entendemos hoje, o tratamento com ASO teria de ser continuado ao longo da vida.

Ao contrário da redução da huntingtina utilizando ASO, as técnicas mais recentes, incluindo nucleases de dedos de zinco e CRISPR/Cas9, são ambas uma forma de técnicas de edição do genoma. Estas novas ferramentas incríveis permitem que os cientistas tenham como alvo a fonte última do problema na HD, o próprio ADN mutante. Estas ferramentas permitem que os cientistas tenham como alvo com precisão um local específico no ADN (como as instruções para produzir a proteína huntingtina) e, em seguida, realizem uma série de truques úteis.

Um destes truques que podem fazer é servir como uma espécie de sinal de stop para a célula. Quando a maquinaria que normalmente lê o ADN chega ao gene HD mutante, as ferramentas de edição do genoma adequadamente concebidas podem chamá-las – dizendo-lhes para não fazerem o seu trabalho naquele gene preciso. Isto resulta em que nenhum mRNA ou proteína huntingtina mutante seja alguma vez produzido. Nota que isto é diferente de como os ASO funcionam, que é degradando o mRNA que já foi produzido.

Uma nova ferramenta importante de edição do genoma chamada CRISPR/Cas9 tem entusiasmado recentemente muitas pessoas. Estas ferramentas, emprestadas de certas espécies bacterianas que as utilizam como uma espécie de sistema imunitário, permitem que as células insiram sequências de ADN estranhas no seu próprio ADN. Humanos realmente inteligentes retiraram essas ferramentas das bactérias e redesenharam-nas para permitir que os cientistas fizessem cortes precisos no ADN em sequências específicas.

Em teoria, e no laboratório, as técnicas CRISPR podem ser utilizadas para cortar sequências de ADN específicas para que a célula deixe de poder ler um gene. Também podem ser utilizadas para direcionar as células para fazerem alterações específicas nas sequências de ADN – mesmo, em teoria, reparando mutações como as que causam a HD. Ter como alvo a causa da HD na sua raiz (o gene HD) garantiria que tanto o mRNA huntingtina mutante como a proteína huntingtina mutante deixassem de ser produzidos e deixassem de poder causar danos.

Segurança em primeiro lugar!

Se te estás a perguntar porque é que ainda não estamos a testar estas novas ferramentas como fármacos, é porque muitas coisas precisam de acontecer no pipeline de desenvolvimento de fármacos para garantir que o produto final é seguro e eficaz antes de poder ser testado em pacientes com HD.

Primeiro, os cientistas precisam de descobrir formas de levar estes fármacos ao cérebro, onde a proteína huntingtina mutante causa a maior parte dos seus danos. Isto é difícil – os nossos cérebros são especialmente bons a manter as coisas afastadas que possam ser prejudiciais e, infelizmente, não vão dar a estes fármacos uma passagem livre. Se tentássemos colocá-los numa pílula ou injetá-los no nosso sangue, os nossos corpos iriam decompô-los e torná-los inúteis muito antes de chegarem ao cérebro.

Como os ASO existem há mais tempo, os cientistas tiveram algum tempo extra para abordar este problema, embora a sua solução ainda esteja longe de ser perfeita. Os ASO que estão a ser utilizados no ensaio humano de HD têm de ser injetados no fluido que banha o cérebro e a espinal medula, o líquido cefalorraquidiano. Temos todas as razões para acreditar que isto vai funcionar, mas é obviamente mais complicado do que apenas engolir uma pílula.

As ferramentas de edição do genoma, como o CRISPR e os Dedos de Zinco, são ainda mais complicadas de administrar do que as suas contrapartes ASO. Isto porque são, na verdade, proteínas e estas são difíceis de administrar intactas nas células.

Para contornar este problema, os investigadores utilizam vírus inofensivos para transportar as instruções de ADN para produzir estas proteínas para as células cerebrais. A partir daí, as células são enganadas para utilizarem a mesma maquinaria que utilizam para construir as suas próprias proteínas para construir ferramentas de edição do genoma, transformando essencialmente as células em fábricas para os seus próprios fármacos!

O que há de novo com os Dedos de Zinco para a HD?

Não sendo de evitar um bom desafio, muitas equipas de investigação têm trabalhado arduamente para abordar as questões mencionadas anteriormente para fazer progressos na aplicação destas novas técnicas à HD. Anteriormente, o HDBuzz noticiou que um grupo de investigadores de Espanha tinha testado um novo fármaco de dedos de zinco que mostrou alguns efeitos benéficos num modelo de ratinho com HD num estudo de curta duração (http://en.hdbuzz.net/103).

Recentemente, a mesma equipa de investigação – liderada por Mark Isalan, que agora reside no Imperial College em Londres, Reino Unido – concebeu e testou uma versão atualizada do seu fármaco para ver se conseguiam aumentar os seus efeitos por um período de tempo mais longo e reduzir a resposta imunitária prejudicial no cérebro associada à administração do fármaco utilizando AAV.

Após algumas alterações bioquímicas intensas, Isalan e os seus colegas conseguiram demonstrar que o seu novo e melhorado candidato a dedo de zinco era mais eficaz do que a sua versão anterior na redução da proteína huntingtina mutante prejudicial, era mais duradouro, era mais seletivo na seleção apenas do gene HD e apresentava um perfil de segurança muito melhor do que a sua versão anterior.

Estas são descobertas muito entusiasmantes, de facto, e todos os passos positivos em frente para tornar a terapia com dedos de zinco uma opção viável para o tratamento da HD humana! Este trabalho lento e paciente com os dedos de zinco é semelhante ao que aconteceu com os fármacos ASO, que tiveram uma vantagem de muitos anos sobre as ferramentas de edição do genoma.

E quanto ao CRISPR?

Apesar de ser considerada a forma mais precisa de conduzir a edição do genoma, a tecnologia CRISPR ainda é a mais recente e os cientistas tiveram muito menos tempo para resolver os problemas em comparação com as outras técnicas.

Num avanço entusiasmante na utilização do CRISPR como uma opção terapêutica na HD, uma equipa de investigadores liderada por Jong-Min Lee no Massachusetts General Hospital desenvolveu recentemente um constructo CRISPR que pode editar seletivamente a cópia mutante, mas não a de tipo selvagem, do gene HD em células numa placa. Tirando partido da capacidade de seleção altamente específica do CRISPR, conseguiram instruir as células tratadas para cortarem o gene HD mutante, deixando a cópia saudável intacta.

É claro que uma coisa é mostrar que um fármaco é eficaz em células numa placa e outra coisa completamente diferente é mostrar que pode ser eficaz quando testado num organismo vivo. Isto é especialmente verdade com técnicas como o CRISPR – tanto quanto sabemos hoje, precisamos de um vírus para transportar as instruções para cada uma das nossas 100 mil milhões de células cerebrais para resgatar cada uma delas dos efeitos do gene HD mutante.

Outro risco é que o CRISPR e outras ferramentas de edição do genoma modifiquem o ADN permanentemente. Isto é diferente de fármacos como os ASO, que acabam por ser eliminados do cérebro, o que significa que os seus efeitos desaparecem com o tempo se não forem administrados novamente.

A princípio, esta ideia parece fantástica! Se pudéssemos curar a HD com apenas um único tratamento, certamente adoraríamos poder fazê-lo. No entanto, ainda não temos a certeza sobre os efeitos a longo prazo associados à eliminação permanente do gene HD e à redução da quantidade de proteína huntingtina que é criada, independentemente de ser mutante ou não. Existe a possibilidade de que a eliminação permanente do gene HD possa levar a alguns problemas de saúde graves de uma variedade diferente a surgir mais tarde e precisaremos de passar um tempo considerável a estudar os seus efeitos antes de sabermos se será seguro.

O que vem a seguir?

Ainda há muito trabalho a ser feito antes que as técnicas de edição do genoma, como os dedos de zinco e os tratamentos CRISPR, se tornem opções viáveis para a doença de Huntington, mas a investigação aqui apresentada mostra que demos alguns passos importantes para realizar este feito.

Embora o trabalho recente mostre que a terapia com dedos de zinco é eficaz num modelo de ratinho com HD – cujos cérebros são menores do que uma moeda de dez cêntimos – será muito mais difícil mostrar que pode ser eficaz em humanos, cujos cérebros são muito maiores, mais complexos e apresentam muitos outros desafios a superar. A terapia CRISPR provavelmente levará ainda mais tempo, uma vez que só agora estamos a chegar ao ponto em que podemos fazer planos para testar a sua eficácia em modelos de ratinhos com HD.

No entanto, isto não é motivo para desanimar e, de facto, pensamos que o oposto é verdadeiro! A parte mais entusiasmante da investigação atual é que mostra que temos múltiplas flechas na nossa aljava enquanto tentamos desenvolver um tratamento de redução da huntingtina para a HD. Mesmo que se revele que uma opção não funciona como esperávamos, estamos a fazer progressos constantes no desenvolvimento de novas terapias que também podem fornecer tratamentos eficazes para a HD.

Esta ideia é uma que muitos estão a começar a perceber rapidamente – recentemente, duas empresas farmacêuticas, a Sangamo Biosciences e a Shire Pharmaceuticals, juntaram forças para acelerar os seus esforços no desenvolvimento do tratamento com dedos de zinco como uma opção terapêutica para a doença de Huntington. Embora leve algum tempo a resolver os problemas, imaginamos que será apenas uma questão de tempo até que o mesmo se torne verdade para o CRISPR. Pessoalmente, achamos que o progresso que foi feito até agora nos dá muito para ficarmos entusiasmados!

Aprende mais

• Estudo original de Lee e colegas que descreve o silenciamento específico do gene HD mutante usando CRISPR em células de pacientes com HD. (o artigo completo requer pagamento ou assinatura)
• Estudo original de Isalan e colegas que descreve o seu trabalho de melhoria dos tratamentos virais com dedos de zinco em modelos de ratinhos com HD (acesso aberto)
• Uma animação interessante que descreve como o CRISPR permite que os cientistas editem o ADN