Bloquear um fragmento tóxico: novo estudo em ratinhos destaca a importância da HTT1a na doença de Huntington

Um novo estudo que utiliza edição genética precisa num modelo de ratinho da doença de Huntington (DH) fornece evidências de que um pequeno fragmento da proteína huntingtina (HTT), chamado HTT1a, é um motor central da DH. Ao reduzir os níveis de HTT1a, os investigadores atrasaram sinais da DH como a agregação de proteínas, restauraram quais genes são ativados ou desativados e trouxeram os biomarcadores de volta ao controlo em ratinhos que modelam a DH. Descobrir a forma mais tóxica da HTT que impulsiona a doença pode ter implicações importantes para a forma como concebemos medicamentos de redução da HTT.

Uma rápida revisão: repetições CAG e HTT1a

Todas as pessoas que têm DH têm uma alteração no código genético do seu gene HTT. Uma sequência repetitiva de letras de ADN C-A-G expande-se para ter demasiadas repetições. Pessoas com 40 ou mais CAGs no seu gene HTT desenvolverão a doença se viverem tempo suficiente, e repetições mais longas estão geralmente associadas a um início mais precoce.

A repetição CAG expandida no gene HTT causa uma expansão correspondente na proteína HTT codificada, que é produzida a partir destas instruções genéticas. Mas a repetição CAG não altera apenas a sequência da proteína. Também afeta a forma como o intermediário entre o ADN e a proteína – o ARN mensageiro – é processado.

Uma cópia da receita genética

O ARN mensageiro é uma molécula de mensagem genética. É produzido como uma cópia fiel da sequência de ADN codificada para um determinado gene, antes de ser usado para produzir a proteína que esta sequência codifica. Isto é um pouco como fazer uma cópia de uma receita de um livro para que possas cozinhar a receita sem ter de ir e vir ao livro original.

Quando a repetição CAG está expandida, um sinal oculto no ARN mensageiro da HTT pode ser ativado. Este sinal é chamado de “polyA críptico” e diz à maquinaria celular para parar de produzir a proteína HTT demasiado cedo. Isto significa que, em vez de produzir a proteína HTT de comprimento total, a célula produz apenas um pequeno fragmento, chamado HTT1a.

HTT1a: uma proteína fragmento tóxica da HTT

O fragmento proteico HTT1a contém a região expandida, codificada pela repetição CAG, que se parece com muitos do mesmo aminoácido glutamina, repetindo-se vezes sem conta. Este fragmento é altamente propenso a aglomerar-se (um processo chamado agregação) e demonstrou ser tóxico em muitos modelos animais e celulares da DH.

Importante, quanto mais longa for a repetição CAG, mais fragmento proteico HTT1a é produzido. Como a repetição CAG pode ficar mais longa em algumas células do corpo em pessoas com DH, um processo chamado expansão somática, pensa-se que a HTT1a é um passo fundamental na forma como a doença progride.

Para compreender melhor isto, os investigadores neste estudo questionaram-se se o aumento na quantidade de HTT1a que é produzida poderia ser o motor que liga a expansão somática ao dano das células nervosas.

Uma estratégia genética inteligente: eliminar os sinais que causam o fragmento

Para testar isto diretamente, a equipa usou um modelo de ratinho da DH que tem quase 200 CAGs no gene HTT. Este é um número de repetições muito mais elevado do que é tipicamente visto em pessoas, mas isto acelera quando os sintomas começam a aparecer nos ratinhos, permitindo aos investigadores obter respostas às suas experiências mais rapidamente. Devido às idiossincrasias dos sistemas de modelos da DH, estes são na verdade chamados ratinhos HdhQ150.

Usando ferramentas CRISPR, que são como tesouras genéticas, eliminaram uma porção do gene HTT que contém o sinal para formar o fragmento HTT1a. Isto deve impedir que o fragmento tóxico HTT1a seja produzido nestes ratinhos, mesmo que o número de CAG seja suficientemente elevado para desencadear as células a criar o fragmento tóxico. Este novo tipo de modelo de ratinho da DH foi nomeado ratinho HdhQ150ΔI, com o Δ (delta) a representar o domínio genético que foi removido.

Também usaram ratinhos com números de repetições CAG que não causam DH para representar a população geral sem DH. Para estes ratinhos, também cortaram o sinal de produção da HTT1a para terem um controlo para os possíveis efeitos da edição genética, não relacionados com o número de CAG. Isto significava que saberiam se os resultados que viam eram por causa da própria edição CRISPR, ou verdadeiramente porque a HTT1a não foi produzida.

O que aconteceu aos níveis de HTT1a nestes ratinhos?

Como esperado, os níveis de HTT1a caíram nos ratinhos HdhQ150ΔI. A molécula de mensagem de ARN da HTT1a estava completamente ausente nestes ratinhos e os níveis de proteína foram reduzidos, mas ainda detetáveis.

Mas porque é que ainda se encontraria alguma HTT1a? Os investigadores sugerem que esta eliminação pode ter levado a maquinaria genética a “ler através” do gene de forma diferente, de uma maneira que ainda produz proteína HTT1a, apenas em quantidades muito baixas.

Importante, os níveis de HTT de comprimento total, tanto não expandida (regular) como expandida (forma DH) permaneceram inalterados. Isto é importante para experiências subsequentes para que a equipa pudesse descobrir que efeitos eram especificamente devidos à redução da HTT1a, não aos níveis totais de HTT.

Um grande atraso na agregação

Um resultado marcante deste estudo foi que aglomerados tóxicos de HTT, ou agregados, foram encontrados no cérebro muito mais tarde nos ratinhos HdhQ150ΔI em comparação com os ratinhos HdhQ150.

Em ratinhos HdhQ150 padrão que modelam a DH, os agregados foram detetados em diferentes regiões do cérebro em ratinhos com 6 meses de idade e continuaram a aumentar à medida que os ratinhos envelheciam. Podes estar a pensar: “Uau! 6 meses é muito jovem!” E terias razão. A cronologia rápida das características da doença DH nestes ratinhos é causada pelo número de repetições CAG muito elevado e é intencional para que os resultados possam ser alcançados mais rapidamente.

No entanto, em ratinhos HdhQ150ΔI que não produziam o fragmento tóxico HTT1a, estes aglomerados foram atrasados vários meses e, em algumas partes do cérebro, não foram evidentes até os ratinhos serem muito mais velhos. Estes aglomerados ainda continham HTT1a, reforçando a ideia de que este fragmento de HTT é importante para desencadear a formação destes aglomerados.

Efeitos na expressão genética

De seguida, os investigadores analisaram quais genes foram ativados e desativados nestes diferentes modelos de ratinho. Esta é uma alteração bem documentada que acontece cedo em diferentes modelos de DH, com uma assinatura específica de alterações de ativação de genes.

Nos ratinhos HdhQ150 com DH, os investigadores descobriram que mais de 1.200 ativações de genes foram alteradas na marca dos 6 meses no estriado, uma região profunda do cérebro mais impactada na DH. Aos 12 meses, isto atingiu mais de 2.800 genes.

Nos ratinhos com menos HTT1a, algumas destas ativações de genes foram restauradas, com uma melhoria de 25 % aos 6 meses e uma melhoria de 40 % aos 12 meses. Quando olharam para outra parte do cérebro chamada hipocampo, também viram melhorias parciais.

Curiosamente, mesmo os baixos níveis residuais de HTT1a nos ratinhos HdhQ150ΔI foram suficientes para começar a corrigir esta marca distintiva da DH.

Biomarcadores: um efeito marcante

Talvez o resultado mais emocionante neste estudo tenha vindo dos níveis de biomarcadores que os investigadores analisaram no plasma e no líquido espinal que banha o cérebro, também chamado LCR. A equipa mediu NfL, um biomarcador geral da saúde cerebral, bem como BRP39, o equivalente em ratinho de um biomarcador humano chamado YKL-40 que corresponde à inflamação.

Nos ratinhos HdhQ150 com DH, ambos os biomarcadores estavam aumentados no LCR aos 12 meses, indicando que os sistemas nervosos destes ratinhos estavam doentes. No entanto, nos ratinhos HdhQ150ΔI, NfL e BRP39 permaneceram em níveis dos ratinhos regulares sem DH aos 12 e 17 meses no LCR, e também foram reduzidos no plasma.

Curiosamente, este retorno aos níveis regulares de biomarcadores do LCR aconteceu mesmo que as alterações de assinatura de ativação de genes tenham sido apenas parcialmente restauradas. Como NfL e YKL-40 podem ser usados em ensaios clínicos humanos para avaliar a saúde cerebral, esta descoberta sugere que reduzir a HTT1a poderia alterar significativamente a biologia da DH.

Ligar os pontos da expansão somática → HTT1a → agregação

A expansão somática de CAG é agora vista por muitos investigadores da DH como um motor da DH. À medida que as repetições CAG se expandem em neurónios mais afetados na DH, os níveis de HTT1a aumentarão. Os cientistas neste estudo propõem um modelo onde:

1. A expansão somática aumenta a repetição CAG e a produção de HTT1a.
2. O aumento da HTT1a leva a mais aglomerados tóxicos nestas células.
3. Os aglomerados impulsionam mais alterações nas ativações de genes.
4. Isto causa então que as células fiquem doentes, levando a alterações nos níveis de biomarcadores.

Propõem que isto poderia ser abrandado ou interrompido reduzindo os níveis de HTT1a para interromper este processo.

O que é que isto significa para as terapias?

Várias abordagens de redução da HTT estão em desenvolvimento ou teste clínico. Muitas reduzem apenas a forma de comprimento total da HTT. Estas incluem o oligonucleótido antissenso (ASO) tominersen da Roche, e moduladores de splicing de pequenas moléculas como votoplam e SKY-0515 da Novartis e SkyHawk respetivamente.

Outros visam o exão 1 para que possam reduzir os níveis tanto da HTT de comprimento total como da HTT1a, incluindo a terapia genética AMT-130 da uniQure e o siRNA ALN-HTT02 da Alnylam Pharmaceuticals.

Este estudo sugere que reduzir apenas a forma de comprimento total da HTT pode não ser tão benéfico e reduzir a HTT1a também pode ser importante. Como a proteína HTT regular tem funções importantes nas células, estratégias que visam especificamente a HTT1a podem ser uma abordagem mais segura e eficiente.

Advertências importantes

Dito isto, há algumas limitações importantes a notar neste estudo. Todos estes dados vêm de ratinhos que modelam a DH e têm uma repetição CAG muito longa (~195). Os ratinhos são um ótimo modelo para os cientistas explorarem este tipo de ideias, mas não vivem nem perto do tempo que as pessoas e a maioria das pessoas com DH tem ~42 CAGs em média, muito menos do que neste sistema modelo.

Ainda assim, os dados deste estudo serão certamente uma fonte de novas ideias para outras equipas acompanharem. Fica atento ao HDBuzz para mais investigação nesta área.

Resumo

• Os investigadores criaram um modelo de ratinho da DH que não produzia tanto do fragmento HTT1a, que se pensa ser tóxico na DH.
• Ao reduzir os níveis da mensagem HTT1a, os investigadores viram atrasos na formação de aglomerados proteicos tóxicos produzidos pela HTT1a.
• Quais genes foram ativados ou desativados imitaram mais de perto os ratinhos sem o gene da DH nestes ratinhos especiais deficientes em HTT1a, e muitos biomarcadores chave regressaram a níveis mais próximos do normal.
• Estas descobertas fornecem evidências de que a HTT1a não é apenas um subproduto da expansão da DH, mas um motor da biologia da DH.