Acaba com os teus CAG: como três letras podem mudar a doença de Huntington

A doença de Huntington (DH) é causada por uma sequência repetida das letras genéticas C-A-G dentro do gene da huntingtina (HTT) acima de um número crítico. Se as repetições excederem 40, os sinais e sintomas da DH começarão nalgum momento da vida dessa pessoa, se esta viver o tempo suficiente. A sequência de CAG causadora da doença expande-se ao longo da vida, particularmente em células cerebrais vulneráveis, o que os cientistas pensam que acaba por desencadear a morte celular.

Uma nova investigação utilizou edição genética de ponta para criar células estaminais humanas com diferentes comprimentos de repetição CAG e grafias genéticas. De seguida, monitorizaram como estas repetições mudaram ao longo do tempo utilizando tecnologia de sequenciação avançada. A equipa descobriu que a inserção de múltiplas “interrupções” genéticas na repetição CAG, quebrando a sequência pura de CAG, trouxe grandes benefícios. O que é que descobriram exatamente e o que significa isto para futuras terapias? Vamos descobrir!

Uma máquina do tempo celular

Imagina ver uma doença desenrolar-se em câmara lenta para poderes acompanhar o momento exato em que as coisas começam a correr mal. É essencialmente isso que os investigadores da Universidade de Milão criaram – uma plataforma para observar o desenvolvimento da DH ao nível celular, repetição a repetição, dia após dia.

A equipa, liderada pela Dra. Elena Cattaneo, criou células estaminais humanas que transportam diferentes versões do gene HTT. Utilizando a edição genética CRISPR, trocaram sequências HTT com vários comprimentos de repetição CAG, variando entre 21 repetições (abaixo do limiar da doença) até 107 repetições (bem dentro do intervalo da doença).

Chamaram a esta coleção de linhas celulares “plataforma CAGinSTEM”, e esta poderá tornar-se uma ferramenta poderosa para compreender como as repetições CAG se comportam ao longo do tempo.

Observar as repetições a crescer

Um dos aspetos mais difíceis de estudar a instabilidade das repetições CAG tem sido medir a expansão com precisão. Os métodos tradicionais de sequenciação podem ter dificuldades com ADN repetitivo. Imagina tentar contar com precisão 42 letras iguais seguidas. É provável que, a certa altura, te perguntes se estavas na 31 ou na 32 e tenhas de recomeçar. O mesmo processo acontece numa experiência quando as máquinas moleculares tentam ler o número de repetições CAG.

Os investigadores resolveram este problema utilizando um tipo especializado de sequenciação que consegue ler sequências muito longas de ADN numa única passagem, mantendo a informação sobre a composição exata da sequência.

Ao longo de 120 dias de cultivo de células em placas, a equipa observou que as células que começavam com 81 e 107 repetições CAG mostravam uma expansão constante e linear das suas repetições. Em contraste, as células com 45 ou menos repetições permaneceram estáveis, sem grandes alterações no seu número de CAG. Quando transformaram estas células estaminais em neurónios estriatais, as células cerebrais mais afetadas na DH, viram padrões semelhantes, com a linha de 107 CAG a mostrar expansão mesmo nos neurónios.

Observar as células antes e depois de se tornarem neurónios permitiu aos investigadores determinar se a divisão celular estava a influenciar a expansão de CAG. Enquanto as células estaminais se dividem repetidamente para criar mais células, a maioria dos neurónios não o faz – são o que os cientistas chamam de “pós-mitóticos”, que significa “após a mitose” ou “após a divisão celular”. Como a expansão de CAG permaneceu em números de repetição muito elevados tanto antes como depois de as células se tornarem neurónios, isto sugere que a divisão celular não é o fator contribuinte.

O poder da interrupção

É aqui que o estudo se torna realmente interessante. A maioria das pessoas (mais de 95 %) tem uma interrupção natural na sua repetição CAG: lê-se CAG repetidamente até ao fim da secção repetitiva, onde se lê CAG-CAA-CAG, com esse CAA único perto do fim. Estudos anteriores em pessoas mostraram que a perda desta interrupção CAA leva a um início mais precoce da doença, enquanto ter um CAA extra atrasa o início.

Os investigadores testaram isto diretamente na sua plataforma celular. Criaram linhas com 107 CAG puros (sem interrupção), linhas com a interrupção única típica, linhas com 2 interrupções CAA e (mais drasticamente) linhas com 4 interrupções CAA estrategicamente colocadas ao longo da repetição.

Os resultados foram impressionantes. A interrupção dupla de CAA reduziu a instabilidade em comparação com a interrupção única padrão. Mas as 4 interrupções internas de CAA pareceram abolir completamente a expansão da repetição ao longo de 120 dias. As repetições simplesmente pararam de crescer, tanto em células em divisão como em neurónios. Muito intrigante!

Mais do que apenas estabilidade

Travar a expansão da repetição seria valioso por si só, mas os investigadores também descobriram que as múltiplas interrupções de CAA traziam outros benefícios, pois pareciam prevenir vários problemas relacionados com a DH nas células.

Os neurónios com a repetição de 107 CAG com a interrupção regular de 1-CAA mostraram dificuldade em desenvolver-se no tipo certo de neurónio. Tinham menos marcadores que os definem como neurónios estriatais e mais marcadores de uma região cerebral diferente, sugerindo que o seu desenvolvimento para este tipo específico de neurónio estava um pouco confuso. Estas descobertas estão em linha com o trabalho de outros laboratórios que utilizam amostras cerebrais de pessoas, que mostraram uma erosão da identidade celular deste tipo de neurónio com a expansão das repetições CAG.

No entanto, a linha interrompida por 4-CAA pareceu manter o desenvolvimento normal dos neurónios estriatais. Isto sugere que as 4 interrupções de CAA preservam a identidade genética dos neurónios estriatais!

A equipa também examinou como o ADN e outras moléculas estavam organizados numa região chamada núcleo das células, uma área de crescente interesse na investigação da DH. As células com 1 interrupção de CAA em 107 repetições tinham, em média, um núcleo mais pequeno, ADN mais compacto que não é transformado em proteína e estruturas interrompidas importantes para regular quais os genes que permanecem desligados durante o desenvolvimento. As 4 interrupções de CAA normalizaram todas estas características, restaurando o tamanho nuclear, a organização do ADN e as características utilizadas para controlar os níveis de diferentes genes.

Curiosamente, alguns aspetos celulares da doença não foram melhorados pelas interrupções de CAA. Os neurónios com repetições interrompidas continuaram a mostrar uma forma celular anormal semelhante à da linha celular com 1 interrupção de CAA em 107 repetições, com ramificações neuronais (dendritos) mais curtas e corpos celulares mais pequenos. Isto sugere que estas características específicas podem depender da proteína codificada pelo gene HTT e das suas repetições, e não da instabilidade do ADN ou da pureza da repetição.

O ADN importa, não apenas a proteína

Durante muitos anos, a investigação da DH focou-se quase exclusivamente na proteína tóxica. Mas este estudo reforça uma mudança de paradigma que está a acontecer na área: a própria sequência de ADN, incluindo a sua pureza e tendência para expandir, parece desempenhar também um papel direto na doença.

E aqui é onde a coisa fica um pouco louca – tanto o CAA como o CAG codificam o bloco de construção da proteína, a glutamina. Por isso, inserir interrupções de CAA não altera realmente a proteína! No entanto, estas interrupções parecem prevenir a expansão da repetição e evitar problemas celulares. Nós dissemos-te que era louco…

Isto parece apoiar o modelo de “duas fases” da DH no que diz respeito à expansão de CAG: herdas uma repetição de CAG que não é abertamente tóxica inicialmente, permitindo tipicamente décadas de vida saudável, mas esta expande-se ao longo da tua vida em certas células cerebrais até ultrapassar um limiar e desencadear a morte celular.

Embora alguns investigadores tenham teorias sobre o comprimento exato que desencadeia a toxicidade relacionada com a expansão de CAG e como exatamente isso acontece, ninguém sabe ao certo. Uma teoria é que a repetição pura de CAG forma estruturas de ADN estáveis que promovem o deslizamento e a expansão quando o gene é copiado. As interrupções de CAA poderiam quebrar estas estruturas, impedindo o processo de expansão.

Uma possibilidade terapêutica?

As descobertas deste trabalho recente levantam uma questão intrigante: poderia a introdução de interrupções de CAA ser terapêutica? Estudos recentes de prova de conceito utilizaram a edição de bases CRISPR para converter alguns CAG em CAA em células e ratinhos, com resultados encorajadores. No entanto, transpor a edição genética para neurónios humanos pós-mitóticos em cérebros vivos enfrenta enormes desafios técnicos – a eficiência da entrega, a precisão e a segurança continuam a ser grandes obstáculos.

Talvez de forma mais imediata, a própria plataforma CAGinSTEM oferece valor para a descoberta de fármacos. Os investigadores podem agora procurar potenciais medicamentos que reduzam a instabilidade da repetição ou atenuem os seus efeitos celulares a jusante, utilizando estas linhas celulares bem caraterizadas e com controlo de qualidade que parecem recapitular fielmente alguns aspetos da patologia da DH.

Proteção natural?

O estudo também sugere uma possibilidade intrigante de que algumas pessoas possam ser portadoras de interrupções internas de CAA que ocorrem naturalmente e que as protegem da doença, apesar de terem repetições CAG no intervalo patogénico.

Embora nunca tenham sido observadas nas bases de dados existentes com informações sobre pessoas que têm DH, tais variantes protetoras poderiam existir em indivíduos pré-sintomáticos que nunca chegam a desenvolver sintomas.

A Conclusão

É importante notar que estudos como este, que cultivam um tipo específico de célula isoladamente numa placa, não recapitulam o que está a acontecer dentro do cérebro, que é composto por muitos tipos de células diferentes, todas ligadas e a comunicar entre si. Estes tipos de estudos são bons para se ter uma ideia do que certos tipos de células estão a fazer sozinhas e como essas alterações relacionadas com a doença podem contribuir para e impactar todo o sistema.

Este estudo acrescenta evidências a outros trabalhos que sugerem que a pureza da repetição CAG afeta diretamente tanto a instabilidade da repetição como a disfunção celular na DH, ao mesmo tempo que desenvolve uma ferramenta que os investigadores podem usar para colocar questões em torno desta descoberta.

Ao prevenir a formação de sequências longas e puras de CAG através de interrupções estratégicas, os investigadores poderão ser capazes de bloquear a expansão da repetição e prevenir múltiplos efeitos relacionados com a DH nos neurónios, tudo isto sem alterar realmente o comprimento da proteína glutamina. Louco!

O trabalho continua a mudar a nossa compreensão do que impulsiona a patologia da DH, enfatizando que não se trata apenas da proteína que fabricas, mas da sequência de ADN que herdas e de como esta muda ao longo do tempo. Embora as aplicações terapêuticas para estas descobertas continuem a ser especulativas, a plataforma CAGinSTEM oferece aos investigadores uma nova e poderosa ferramenta para compreender os mecanismos da DH e testar potenciais intervenções.

Resumo

• A plataforma: Investigadores criaram linhas de células estaminais humanas com controlo de qualidade com diferentes comprimentos e composições de repetição CAG no gene da huntingtina (HTT)
• Monitorização avançada: Utilizando sequenciação de ADN de leitura longa, mediram as alterações nas repetições CAG ao longo do tempo, tanto em células em divisão como em neurónios
• O comprimento importa: Linhas celulares com 81-107 repetições CAG mostraram expansão linear ao longo do tempo, enquanto repetições mais curtas permaneceram estáveis
• Puro vs. interrompido: Repetições padrão com uma interrupção de CAA perto do fim continuaram a expandir-se; a adição de uma segunda interrupção de CAA reduziu a expansão
• Bloqueio completo: A inserção de 4 interrupções de CAA ao longo da repetição pareceu travar a expansão tanto em células em divisão como em neurónios pós-mitóticos
• Resgate celular: As 4 interrupções de CAA preveniram múltiplos efeitos celulares da DH, incluindo o desenvolvimento deficiente de neurónios estriatais, a organização nuclear interrompida e níveis genéticos alterados, tudo sem alterar o comprimento da proteína glutamina
• Doença impulsionada pelo ADN: As descobertas contribuem para a teoria de que a pureza e a instabilidade da repetição, e não apenas o comprimento da proteína poliglutamina, impulsionam diretamente a patologia da DH
• Uma ferramenta de investigação: A plataforma CAGinSTEM oferece um sistema robusto para estudar os mecanismos da DH e testar potenciais terapias