Capturar uma Proteína Gigante: Cinco Novas Formas de Agarrar a Huntingtina

A doença de Huntington (DH) é causada por uma alteração num único gene conhecido como huntingtina. Este gene contém as instruções para produzir a proteína huntingtinaproteína huntingtina A proteína produzida pelo gene da DH. Apesar de já terem passado mais de três décadas desde a descoberta do gene da DH, os cientistas ainda estão a tentar perceber exatamente o que faz a proteína huntingtinaproteína huntingtina A proteína produzida pelo gene da DH em células saudáveis e como a versão da DH causa doença.

Uma razão para o progresso ter sido tão lento é que a huntingtina é mesmo difícil de estudar. É enorme, dobra-se de formas complicadas e as ferramentas de que os cientistas dispunham não eram muito boas a agarrá-la. Num novo estudo, uma equipa do Canadá e do Japão criou ferramentas químicas totalmente novas: pequenos anéis de proteína chamados macrociclos que conseguem agarrar a huntingtina em cinco pontos diferentes. Então, o que fizeram, o que aprenderam e porque é que isto importa para a DH?

Uma proteína gigante difícil de ver

Para perceber o desafio, ajuda imaginar a huntingtina. Se a maioria das proteínas é como eletrodomésticos comuns com uma única função, a huntingtina é mais como uma cozinha completa — construída para apoiar muitas tarefas diferentes ao mesmo tempo.

É uma cadeia muito longa que se dobra em dois grandes “blocos” ligados por uma ponte flexível. A alteração genética que causa a DH está logo no início da proteína huntingtinaproteína huntingtina A proteína produzida pelo gene da DH, onde um segmento curto repetitivo (feito de um bloco de construção chamado glutaminaglutamina o aminoácido que é repetido demasiadas vezes no inicio da proteína huntingtina mutante) se expande de forma anormal. As pessoas costumam ter cerca de 20–35 destas glutaminas; na DH, esse número sobe acima de 35 e pode chegar a 50, 80 ou mais.

A huntingtina tem muitos trabalhos no corpo. Ajuda a transportar coisas dentro das células, permite que as células se dividam e limpa lixo. Mas não sabemos exatamente como faz tudo isto.

Há uma coisa que sabemos com certeza: a huntingtina tem um melhor amigo chamado HAP40, uma proteína mais pequena que se liga a ela, conhecida como parceiro de ligação. Até agora, o HAP40 tem sido o único parceiro de ligação para o qual os cientistas têm uma imagem estrutural detalhada. Determinar o que mais a huntingtina faz, e com quem, tem sido limitado pela falta de ferramentas precisas e específicas para a agarrar.

Construir ganchos moleculares

Para criar melhores ferramentas, os cientistas usaram um sistema engenhoso chamado RaPID. Pensa no RaPID como uma enorme festa de “speed dating” entre pequenos peptídeos (pequenos pedaços de proteína) e a huntingtina. A equipa criou uma coleção supergigante de cerca de um trilião de peptídeos minúsculos diferentes — isto é, 1 seguido de 12 zeros!

Cada peptídeo foi dobrado num anel fechado, um pouco como um elástico. Uma forma em laço ou dobrada consegue agarrar-se às coisas mais facilmente do que um fio direito, tal como um clip de papel dobrado consegue prender-se a objetos, enquanto um arame direito simplesmente desliza.

Cada pequeno anel de peptídeo tinha a sua própria etiqueta (feita de ADN) ligada a ele. Assim, quando um anel se ligava à huntingtina, os cientistas podiam ler a etiqueta e saber exatamente qual era o peptídeo. Fizeram várias rondas de “pesca” para expor a coleção de peptídeos em anel à huntingtina, quer sozinha quer ligada ao seu amigo HAP40. Reduziram o conjunto apenas aos mais “pegajosos” e cinco peptídeos em anel destacaram-se como os melhores ligantes da huntingtina: HL2, HL5, HD4, HHL1 e HHD3.

Ver exatamente onde cada anel de peptídeo se cola

Encontrar anéis de peptídeos que se colam à huntingtina é apenas o primeiro passo. A seguir, os cientistas quiseram saber onde é que cada um agarrava a huntingtina e com que força. Usaram três métodos interessantes para descobrir isto:

• Testes que medem quão fortemente os anéis se agarram. Os cinco anéis agarraram-se mesmo com muita força, suficiente para serem ferramentas úteis e talvez até um ponto de partida para potenciais medicamentos que possam “pescar” huntingtina tóxica.
• Um método chamado HDX-MS que mostra que partes de uma proteína ficam tapadas quando um anel se liga a ela. Quando um anel se liga à huntingtina, protege certos pontos, deixando uma “pegada” que ajuda os cientistas a perceber onde o anel está a aterrar.
• Microscopia crioeletrónica (cryo-EM), que é um microscópio superpotente que congela proteínas e faz imagens 3D tão nítidas que dá para ver átomos individuais. (Sim, é tão fixe quanto parece.) Isto mostrou os contactos exatos que cada peptídeo faz com a proteína huntingtinaproteína huntingtina A proteína produzida pelo gene da DH.

Eis o que descobriram: dois anéis (HL2 e HD4) agarram a huntingtina em pontos longe do seu melhor amigo HAP40.

Dois outros anéis (HHL1 e HHD3) só funcionam quando o HAP40 está presente, encaixando-se num pequeno bolso mesmo entre os dois amigos e dobrando-se numa forma parecida com o número 8 para caber.

O último anel (HL5) só gosta da huntingtina quando ela está sozinha, sem HAP40.

E aqui vai um ponto importante: os cinco anéis agarraram tanto a huntingtina saudável como a huntingtina expandida igualmente bem, o que é especialmente útil numa ferramenta concebida para estudar a proteína tanto em células saudáveis como doentes.

Pescar os amigos da huntingtina em células reais

Ferramentas úteis têm de funcionar na vida real, não apenas em tubos de ensaio. Por isso, os cientistas adicionaram um pequeno gancho (chamado biotina) aos seus anéis de peptídeos, como um anzol numa linha. Os cientistas usaram estes peptídeos como isco para ver se conseguiam capturar huntingtina em células humanas cultivadas em placas, juntamente com tudo o resto que estivesse ligado a ela.

Um amigo da huntingtina destacou-se muito acima dos restantes — o HAP40. Apareceu repetidamente, em todos os tipos de células que os cientistas testaram, incluindo células semelhantes às do cérebro, parecidas com as que são danificadas na DH. Mesmo em células com repetições CAG mais longas (como Q45 ou Q81), a huntingtina tinha sempre HAP40 ligado a ela.

Mais de 3.000 outras proteínas foram reportadas como interagindo com a huntingtina, mas esta experiência mostra que o HAP40 é o que está realmente lá o tempo todo. Isto sugere fortemente que a huntingtina e o HAP40 funcionam como uma única unidade na maior parte do tempo, e que a forma “real” da huntingtina dentro das células pode ser quase sempre o par huntingtina–HAP40.

Porque é que isto importa para a doença de Huntington

Estes novos anéis ainda não são medicamentos, e os cientistas têm o cuidado de não dizer que são. Mas abrem muitas portas entusiasmantes.

Primeiro, funcionam tão bem como as ferramentas que os cientistas usavam antes para se ligar e visualizar a huntingtina (chamadas anticorpos), mas são mais pequenos, mais baratos e conseguem agarrar muitas partes diferentes da huntingtina, não apenas uma. Também são suficientemente pequenos para, possivelmente, conseguirem entrar em células vivas e ligar-se à huntingtina, algo que os anticorpos atuais não conseguem fazer. Isso permitiria aos cientistas estudar a huntingtina dentro de células vivas de formas que atualmente são impossíveis.

Segundo, as imagens 3D de alta resolução destes anéis de peptídeos ligados à huntingtina são como plantas para o desenho de futuros medicamentos. Por exemplo, a forma em “8” mostra dois pequenos bolsos no ponto de encontro huntingtina–HAP40 que futuros medicamentos poderiam visar, potencialmente para “pescar” huntingtina tóxica. Os anéis também podem ser usados como a parte de “agarre” de novas ferramentas interessantes como PROTACs (ferramentas que dizem à célula para deitar a huntingtina no lixo) ou traçadores PET que poderiam ajudar os médicos a visualizar a huntingtina dentro do cérebro dos doentes.

Terceiro, o facto de a huntingtina estar quase sempre com o HAP40 dentro das células muda a forma como devemos abordá-la. Se queremos perceber o que a huntingtina faz, ou como a corrigir quando muda e se torna tóxica, provavelmente precisamos de a estudar com o HAP40, e não sozinha. Os cientistas têm agora um conjunto mais preciso de ferramentas para investigar o mistério de saber se a huntingtina consegue funcionar sem HAP40.

Olhando para o futuro

Como toda a ciência, este artigo deixa muitas perguntas. Os anéis agarram a huntingtina saudável e a huntingtina da DH da mesma forma, por isso ainda não nos conseguem dizer como visar apenas o tipo prejudicial, algo em que os investigadores ainda estão a trabalhar.

Os próximos passos serão testá-los dentro de animais vivos e redesenhá-los para conseguirem entrar nas células. Também foram encontrados alguns novos possíveis parceiros de ligação da huntingtina, como ACADVL e HEY1, para os quais são necessários mais testes para confirmar.

Esta investigação dá à comunidade da DH um conjunto totalmente novo de ferramentas para uma proteína que tem sido muito difícil de agarrar. Tal como microscópios incríveis mudaram o que os cientistas conseguiam ver, estes pequenos anéis de peptídeos prometem transformar o que podemos perguntar sobre a função da huntingtina, na saúde, na doença e na procura de uma cura.

Resumo

• A doença de Huntington (DH) é causada por uma alteração que torna a proteína huntingtinaproteína huntingtina A proteína produzida pelo gene da DH anormalmente longa. Os cientistas ainda não sabem totalmente o que esta proteína faz, porque é enorme e difícil de estudar com as ferramentas existentes.
• Usando um sistema chamado RaPID, a equipa testou cerca de um trilião de pequenos fragmentos de proteína em forma de anel e identificou cinco que se ligam de forma forte e específica à huntingtina, cada um num ponto diferente e bem definido.
• Um microscópio de alta resolução mostrou exatamente como os anéis se ligam à huntingtina. Dois deles até se dobram numa forma em “8” para encaixar num bolso entre a huntingtina e o seu melhor amigo HAP40.
• Quando os anéis foram usados para “pescar” huntingtina a partir de células humanas reais, quase sempre capturaram HAP40 juntamente com ela, independentemente do tipo de célula ou do comprimento da repetição CAGrepetição CAG A porção de ADN no início do gene DH, que contem a sequência CAG repetida muitas vezes, e que é anormalmente longo nas pessoas que vão desenvolver DH..
• Estes anéis são relativamente baratos, pequenos e flexíveis, por isso podem ajudar a criar futuros medicamentos para a DH, ferramentas de imagiologia cerebral e novas formas de destruir huntingtina prejudicial.