Reduzir a atividade dos genes de reparação de erros de emparelhamento abranda o crescimento das repetições da Huntington em neurónios humanos

Os cientistas utilizaram células de uma pessoa com a doença de Huntington (DH) para testar se a redução dos níveis dos genes de reparação do ADN pode abrandar o crescimento da nefasta repetição CAG. Nestas células humanas cultivadas em laboratório, a repetição cresceu, de facto, mais lentamente, sugerindo uma potencial estratégia terapêutica para possivelmente atrasar o início e a progressão da doença, embora este trabalho ainda esteja numa fase inicial.

Porque é que a expansão das repetições CAG é importante na DH

A DH é causada por um segmento anormalmente longo de três letras de ADN, CAG, no gene da huntingtina, frequentemente abreviado para HTT. Geralmente, o aumento do comprimento da repetição CAG expandida está associado ao aparecimento mais precoce de sintomas da DH e a uma progressão mais rápida da doença.

Sabemos agora que, para as pessoas com DH, o comprimento de CAG que uma pessoa herdou não é fixo para a vida toda. Em algumas células, especialmente numa região do cérebro situada sensivelmente no meio da cabeça, chamada estriado, a repetição CAG pode crescer lentamente ao longo de muitos anos. Este processo chama-se expansão somática — a expansão da repetição CAG em células “somáticas”, ou células do corpo.

Evidências de tecido cerebral humano e de animais que modelam a DH sugerem que este crescimento extra (expansão somática) é um impulsionador significativo da vulnerabilidade destes neurónios e é um fator importante na progressão da doença.

Reparação do ADN: um impulsionador fundamental da expansão CAG

O nosso ADN é constantemente danificado por coisas como a exposição UV do sol, poluentes ambientais e stress dentro das nossas células. Mas as células estão sempre a trabalhar para reparar estes danos no seu ADN. Um sistema crítico responsável por manter a integridade do material genético chama-se Reparação de Erros de Emparelhamento (MMR). Atua como um revisor molecular, localizando e corrigindo pequenos erros para manter a integridade genética.

No entanto, a sequência CAG altamente repetitiva no gene HTT é estruturalmente instável e pode formar formas invulgares, como laços de ADN. Quando os componentes do sistema MMR encontram estas estruturas estranhas, pensa-se que o processo de reparação interpreta mal o código de letras do ADN, um pouco como se o sistema de revisão aceitasse erros de dactilografia.

Estes erros de revisão pelo sistema MMR podem levar à incorporação de repetições adicionais. Neste contexto, o sistema MMR, que normalmente protege o código genético, torna-se inadvertidamente num mecanismo importante que impulsiona a expansão prejudicial da repetição CAG.

Este papel destrutivo do MMR ao contribuir para a DH é fortemente apoiado por investigação de longa data. Estudos genéticos de larga escala, conhecidos como Estudos de Associação de Genoma Completo (GWAS), em pessoas com DH confirmaram esta ligação ao identificar diferenças genéticas naturais (variantes) em vários genes associados ao MMR que modificam a idade em que os sintomas começam.

Estas descobertas estabeleceram estratégias terapêuticas convincentes. Se conseguirmos reduzir com segurança a atividade ou os níveis de genes MMR específicos, poderemos ser capazes de abrandar eficazmente este processo de expansão na sua origem.

Estudar a reparação de erros de emparelhamento em neurónios humanos com DH

A maior parte da investigação anterior sobre a reparação de erros de emparelhamento e a expansão CAG utilizou ratinhos que modelam a DH ou células animais cultivadas em laboratório. Num estudo recente liderado pela Dra. Sarah Tabrizi, da University College London, os investigadores utilizaram um sistema mais diretamente relevante para os seres humanos.

Começaram com células da pele doadas por uma menina de sete anos com DH de início juvenil, que era portadora de uma repetição CAG expandida muito grande, superior a 125, no gene HTT. Os cientistas adicionaram moléculas que persuadiram as células da pele a tornarem-se células estaminais, que são capazes de se autorrenovar e podem ser orientadas para se tornarem vários tipos de células, incluindo células cerebrais.

Utilizando protocolos que adicionam diferentes produtos químicos em diferentes momentos, a equipa converteu as células estaminais da DH em células cerebrais enriquecidas com neurónios espinhosos médios (MSNs) que se encontram no estriado, uma região central do cérebro fortemente afetada pela DH. Os MSNs são células cerebrais específicas conhecidas por serem particularmente vulneráveis à degenerescência na DH. Os investigadores mediram consistentemente o comprimento da repetição CAG tanto nas células estaminais em divisão como nestas culturas de células cerebrais para monitorizar como o comprimento da repetição mudava ao longo do tempo.

Utilizar um regulador de intensidade molecular

Para testar o papel da reparação de erros de emparelhamento, utilizaram uma ferramenta genética poderosa chamada interferência CRISPR (CRISPRi). O CRISPRi atua como um sistema molecular para reduzir precisamente a atividade genética num gene de cada vez. Este sistema é distinto da edição genética padrão porque não corta o ADN. Em vez disso, utiliza uma molécula que podes imaginar como uma tesoura molecular, chamada Cas9, que está ligada ao nível molecular a um regulador de intensidade (dimmer) que baixa eficazmente os níveis de uma proteína alvo.

A equipa utilizou o CRISPRi para reduzir a atividade dos genes de reparação de erros de emparelhamento que foram identificados nos estudos genéticos humanos (GWAS). Também visaram os parceiros desses genes MMR. Os genes visados incluíram componentes das famílias de complexos multiproteicos, a família MutS (MSH2, MSH3, MSH6) e a família MutL (MLH1, PMS1, PMS2, MLH3), juntamente com a enzima ADN ligase 1 (LIG1).

O objetivo do estudo era reduzir a sua atividade para níveis realisticamente alcançáveis por fármacos terapêuticos, em vez de eliminar os genes completamente. Esta abordagem permitiu-lhes imitar de forma mais realista o que poderia ser desenvolvido como um tratamento ou imitar as variantes que ocorrem naturalmente em pessoas com DH que tiveram um início de sintomas mais tardio.

Em seguida, os investigadores verificaram se as suas experiências tinham sido bem-sucedidas, pelo que realizaram outra experiência chamada “ensaio de deficiência de MMR”. Isto permitiu-lhes confirmar que estavam realmente a baixar a atividade dos genes alvo de MMR. Para o fazer, trataram as células com um produto químico que imita danos no ADN. Em células que têm um sistema MMR totalmente funcional, este produto químico desencadeia normalmente a morte celular. Mas se a função do MMR estiver comprometida, as células conseguem sobreviver.

A experiência confirmou que o sistema MMR nas células modificadas estava enfraquecido, mostrando um aumento da sobrevivência celular em comparação com os controlos. É importante notar que a redução da função não foi total, alinhando-se com o objetivo de redução parcial e dando aos investigadores um sistema onde podem regular molecularmente os níveis destes genes para os diminuir em vez de os desligar.

O impacto da redução da atividade dos genes MMR nas expansões CAG

Finalmente, analisaram a taxa a que a repetição CAG se expandia tanto nas células estaminais em divisão como nos neurónios estriatais especializados, comparando as taxas de expansão com e sem a atividade reduzida dos genes de reparação de erros de emparelhamento.

Nas células estaminais da DH, a repetição CAG cresceu normalmente ao longo do tempo, o que era esperado. Mas quando vários genes de reparação de erros de emparelhamento foram reduzidos com CRISPRi, este crescimento abrandou, sugerindo que a teoria da equipa estava correta! Os efeitos de abrandamento mais fortes foram observados quando a equipa reduziu os principais componentes MutS (MSH2 e MSH3) e o componente central MutL (MLH1). A redução destes genes diminuiu a taxa de expansão nas células estaminais em divisão entre 60 % e 65 %, com outros fatores MutL (PMS1, PMS2 e MLH3) a reduzirem a taxa em 25-35 %.

Mais importante ainda, padrões semelhantes foram observados nas culturas de células cerebrais feitas a partir das mesmas células estaminais da DH. Os investigadores concentraram-se estrategicamente nos fatores MutL (PMS1, PMS2 e MLH3) nos neurónios, uma vez que as experiências anteriores com células estaminais excluíram o MSH6 e o LIG1, e o MSH2 apresentava potenciais preocupações de segurança devido ao risco de cancro. Também não aprofundaram o MSH3, uma vez que este está a ser ativamente explorado como alvo terapêutico noutros locais.

Nos neurónios, com o MLH1 reduzido, esta expansão abrandou 69 %, e visar o PMS1, PMS2 ou MLH3 também abrandou a expansão em mais de 20 % em comparação com as células de controlo. Isto mostra que a reparação de erros de emparelhamento continua a ser um impulsionador fundamental da expansão somática em neurónios humanos com DH, e não apenas em células estaminais em divisão ou em ratinhos. Além disso, mostra que, ao ajustar os níveis destes genes MMR específicos, os investigadores podem ser capazes de abrandar significativamente a expansão somática. Uma perspetiva muito entusiasmante!

O que o estudo descobriu e o que não mostra

Em termos simples, a mensagem central desta investigação é: em neurónios humanos cultivados em laboratório que foram criados a partir de alguém com DH, reduzir a atividade dos genes de reparação de erros de emparelhamento parece ser suficiente para abrandar o crescimento da repetição CAG prejudicial.

Este trabalho é encorajador para a ideia de terapias de “anti-expansão”. Ao mesmo tempo, é importante ser claro sobre o que este estudo não mostra. Todo o trabalho foi feito em células em laboratório, não em cérebros vivos. Foi utilizada apenas uma linha de células estaminais de DH de início juvenil, com uma repetição muito longa.

O estudo mediu o comprimento da repetição CAG e a sua distribuição. Não testou a sobrevivência dos neurónios, o comportamento ou a função cerebral. Também não abordou a segurança a longo prazo. Os genes de reparação de erros de emparelhamento ajudam a proteger todos os tecidos do cancro, e alterar a sua atividade em pessoas acarreta riscos de causar cancro, especialmente porque a perda de genes como o MSH2 e o MLH1 está associada a um risco significativamente aumentado de cancros do sistema nervoso, com o PMS2 a acarretar também algum risco.

O que o trabalho fornece é uma lista mais realista de genes de reparação de erros de emparelhamento que parecem promissores num contexto de DH humana, destacando membros da família MutL, particularmente o PMS1, como potenciais alvos. Apoia a ideia de que reduzir cuidadosamente a atividade de genes de reparação de erros de emparelhamento selecionados, provavelmente num grau moderado e possivelmente em combinação, pode ser uma forma valiosa de abrandar a expansão CAG. Esta informação poderá ajudar a orientar a conceção e a priorização de futuras terapias que visem não apenas tratar os sintomas, mas alterar o ritmo da própria doença de Huntington.

Resumo

• A reparação de erros de emparelhamento impulsiona a expansão CAG em neurónios humanos: Utilizando células cerebrais criadas a partir de uma pessoa com DH que foram cultivadas em laboratório, os investigadores confirmaram que o sistema de reparação de erros de emparelhamento impulsiona o crescimento da repetição CAG em neurónios humanos, e não apenas em ratinhos ou células em divisão.
• Reduzir a atividade dos genes de reparação abrandou a expansão: Ao reduzir parcialmente a atividade de genes específicos de reparação de erros de emparelhamento, a equipa abrandou o crescimento da repetição CAG em até 69 % nos neurónios, com membros da família MutL, particularmente o PMS1, a emergirem como potenciais alvos terapêuticos.
• As descobertas genéticas têm agora apoio experimental em células humanas: Grandes estudos genéticos apontaram anteriormente os genes de reparação de erros de emparelhamento como modificadores do início da DH. Este estudo confirma o seu papel em neurónios humanos cultivados em laboratório e ajuda a priorizar quais os genes a visar. O trabalho foi feito numa única linha celular em laboratório, mas é um passo importante para terapias que visam abrandar a expansão CAG.